在年12月，中国武汉报道了由未知感染引起的非典性肺炎暴发。之后该病进一步传播到了中国的其他城市甚至海外。由于这是一种病因不明的暴发性疾病，因此本研究报告了基于RNA的宏基因组下一代测序（mNGS）方法用于快速鉴定和鉴定潜在病原体的特点，对于疾病控制和预防非常重要。
前言
全球范围内新发传染病的流行对公共卫生构成了巨大威胁。大多数流行病是由病*跨物种从动物传播给人类引起的。通过快速准确的诊断方法进行监视对于疾病控制和患者治疗至关重要。得益于mNGS方法的发展，目前可以直接研究来自原始临床样品的传染性微生物。尤其是，基于RNA的mNGS方法可以同时揭示生物体内存在的整个“感染组”（即RNA病*，DNA病*，细菌和真核生物）。此外，RNA测序超越了病原体的识别范围，可揭示有关病原体丰度、基因组序列和基因表达的相关数据，提供了对疾病原因的重要解释，从而使其成为信息时代的前卫诊断工具。
材料与方法
本研究调查了与华南海鲜市场接触后出现急性呼吸窘迫综合征的两名患者。两名患者具有共同的临床特征，包括发烧，咳嗽以及双侧肺叶中出现片状混浊。本研究重点介绍了对从支气管肺泡灌洗液（BALF）提取的低浓度RNA的mNGS方法的使用。
患者1是华南海鲜市场的一名39岁男职员，在年12月25日入院前经历了发烧（37.7°C）并伴有泡沫白痰的咳嗽加剧。患者2是21岁的女性，在年12月22日与华南海鲜市场工作人员接触后出现间歇性发热性咳嗽，发冷，发烧（40°C）和泡沫白痰，于12月28日因门诊未成功而入院治疗。
表1两名患者住院第一天的临床实验室检查
注：WBC：白细胞计数；Hb：血红蛋白；AST：天冬氨酸转氨酶；ALT：丙氨酸转氨酶；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸酐激酶–MB同工酶；LDH：乳酸脱氢酶；UREA：尿素氮；CREA：肌酐。图1两例确诊患者肺部成像
年1月2日。从两名患有异常肺炎的患者中获得了BALF样本。年1月3日。进行SARS特异性RT-PCR分析，产生部分RdRp片段，并揭示了潜在的病原体。年1月4日。扩展RdRp片段并获得更多的基因组片段，并开始准备mNGSRNA文库。年1月5日。完成了mNGSRNA文库的制备。年1月6日。开始在Miseq平台上进行mNGS测序。年1月7日。收到测序数据，启动病原体鉴定流程，获得病*基因组。年1月8日。进行了基因组比较和进化分析。自年1月3日起，即时进展报告已发送到中国疾病预防控制中心（CDC），与病原体鉴定和表征方面取得的每个进展保持同步。从BALF样品中提取的总RNA进行mNGS测试。根据QubitRNAHS分析试剂盒（ThermoFisherScientific）的测量，RNA样品的浓度较低（0.5ng/ul），因此文库的制备使用了靶向目标的TrioRNA-Seq试剂盒（NuGENTechnologies，USA），该试剂盒靶向浓度RNA样品，并含有去除人核糖体RNA的AnyDeplete探针。用IlluminaMiseq平台进行测序。
为了从mNGS测序结果中识别出潜在的病原体，从数据集中删除了包含衔接子序列和低复杂区域的读段，还通过针对参考人类基因组作图来去除人类读物，然后将所有非人类和非重复序列读取的数据与参考病*数据库进行比较。使用基于NGS序列设计的引物通过Sanger测序确认了病*基因组。
结果
年1月3日，对从患者那里获得的呼吸道和血液样本进行了常规临床实验室检查，以检查呼吸道病原体，包括流感病*，呼吸道合胞病*，腺病*，间质肺病*，支原体肺炎，嗜衣原体肺炎和*团菌，结果均为阴性。其余的RNA样品首先经过世界卫生组织（WHO）推荐的SARS-CoV特异性RT-PCR分析。但是，只有一组产生了明显的结果（图2A）。相应的PCR产物的进一步测序表明，发现的病*与BtCoV/（97.35％）更紧密相关，而与SARS-CoV不相关（图2B）。
图2RT-PCR检测，扩增和序列分析的第一轮研究注：（A）将RNA样品按指示进行SARS-CoV特异性RT-PCR引物组，仅SAR1-s/组显示出明显的条带。泳道1、6、11、16、21是患者1的样本。2、7、12、17、22是患者2的样本。其他是与本研究无关的其他患者的样本。（B）患者1和2的PCR产物的Blast结果。
年1月4日，在第二轮RT-PCR分析中，使用了基于第一轮Blast分析设计的新引物组，鉴定了延伸的RdRp片段和更多的基因组片段，进行了测序和分析。这些数据进一步表明，异常肺炎的病原体可能是冠状病*，而不是SARS-CoV。
图3识别异常肺炎的第二轮研究注：（A）泳道1、3、5、7、9、11、12、13、14、15、21、23、25、27是患者1的样品。泳道2、4、6、8、10、16、17、18，19、20、22、24、26、28是患者2的样品。（B）对患者1和2的PCR产物进行了测序，并显示了Blast结果。
从患者1和2获得的共有基因组序列相同。表明这两个个体患者分别在同一时间被同一冠状病*感染。根据WHO的公告，我们将这两种临床分离株分别命名为-nCoV株WHU01和WHU02。
进一步分析了-nCoV的基因组，以确定其起源和进化史。完整的基因组比较表明，-nCoV与Rhinolophus（马蹄蝠）中循环的CoV接近。与目前已知的人类冠状病*（包括SARS-CoV）（79.7％）截然不同。
图4新发现的冠状病*的起源和进化史
注：（A）为了清楚起见，仅显示与人相关的病*的名称。与蝙蝠相关的多样性分别用蓝色和绿色阴影分别表示alpha-CoV和beta-CoV。（B）新鉴定的病*的基因组结构及其在整个基因组的bp中与bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV的序列相似性。重组断点显示为垂直虚线。（C）WHU病*与其他SARS样冠状病*之间的关系。系统发育基于四个基因的核苷酸序列重建（1a，1b，S和N）。在S基因处与WHU分组的那些标记为红色，在S基因处与SARSCoV分组的标记为蓝色。
结论
本研究从两名不寻常的肺炎患者中鉴定出了一种新的冠状病*。尽管尚无更多的实验数据证实与该疾病的直接相关性，但研究结果提供了几条证据，表明该病*最有可能与该疾病相关：
（1）病*滴度非常高，丰度达到已测序的总读数的1.5％和0.62％，超过了最高表达的宿主基因，成为宿主转录组中最主要的RNA分子之一，这是该病*随后正在主动复制的重要标志；（2）由于RNAmNGS方法靶向是总感染组（病*除外），而从受感染的样本中未发现其他病原体，这一事实表明了-nCoV发挥的独特作用；（3）该病*被归类于冠状病*进化枝（即SARS样），具有跨病*传播给人类的历史，并已被证明具有很强的人畜共患病潜力。总的来说，这些结果利用RNA宏基因组学中存在的丰富信息来评估潜在的病原体，这突出了信息时代病*诊断的未来趋势。
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